NADPH氧化酶1在胆囊癌组织中的表达及

施永恒1，陈晓宇2，刘强1，王坚3

（上海交通大医院，上海，1.病理科，2.消化科，3.胆胰外科）

胆囊癌是胆道系统最为常见的恶性肿瘤（占41.3%），早期诊断困难，恶性程度高，手术根治性切除率低，预后差[1-3]。胆囊癌细胞侵袭性高、转移速度快是造成其临床疗效差的主要原因[4]。由于胆囊癌患者早期多无显著临床症状，大多数初诊患者已经发展为晚期阶段，并有61.5%～63.8%患者已发生转移[5]。因此，对胆囊癌侵袭转移相关蛋白的研究，有助于及时评估胆囊癌患者转移情况及临床预后，为胆囊癌患者的后续治疗提供依据。

氧化应激反应是指机体在遭受各种有害刺激时，机体内高活性分子如活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）和活性氮产生过多，超出机体抗氧化能力，产生大量的氧化中间产物，从而损伤机体组织[6]。氧化应激反应与机体的衰老及疾病的产生密切相关，并且氧化应激反应的主要介导者ROS在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用[7-8]。ROS是细胞内有氧呼吸时线粒体电子链传递过程中一小部分氧不能被完全还原的产物的总称，包括O2-、OH-、H2O2等小分子物质[9]。NADPH氧化酶1（NOX1）是细胞内一种重要的氧化酶，能够催化NADPH转化成NADP+，并产生O2-，因此是细胞内ROS的主要来源[10]。现阶段研究表明NOX1在多种肿瘤中高表达，并在乳腺癌和卵巢癌的发生和转移中发挥了关键性作用[11-13]。但目前关于NOX1在胆囊癌中的研究较少，本研究通过检测胆囊癌及正常胆囊组织中的NOX1表达情况，并分析其与胆囊癌患者的临床病理特征及预后之间的关系，为早期评估胆囊癌转移情况寻找新的方法。

1材料和方法

1.1

研究样本

胆囊癌组样本：收集于年1月至年10月期间在上海交通大医院胆囊癌石蜡样本86例，其中36例匹配新鲜组织样本，所有患者均经病理明确诊断为胆囊癌。正常胆囊组样本：纳入36例同期胆囊结石患者作为正常胆囊对照组，并收集其石蜡样本及新鲜组织样本。

1.2

研究方法

1.2.1标本处理：将收集的86例胆囊癌和36例胆囊结石石蜡标本作4μm厚的连续切片3张，所有玻片均经过APES防脱片预处理，50℃烘片2h，用于免疫组化染色。36例胆囊癌和36例正常胆囊组织取自术后切除标本，并立即冻存于液氮中保存。

1.2.2免疫组化染色：采用即用型快速免疫组化（MaxVisionTM）法，切片脱蜡及脱水处理后，滴加一抗（NOX1，美国Sigma公司，1:稀释；Ki-67及P53，福州迈新试剂公司，1:稀释）4℃过夜，PBS清洗后，滴加二抗试剂，室温孵育1h，PBS再次清洗后DAB显色。阳性对照采用卵巢癌石蜡切片组织进行染色，阴性对照则用PBS代替一抗进行染色。

1.2.3切片染色结果判定：免疫组化目的蛋白染色呈棕黄色颗粒状，参照Kohlberger等[14]采用的半定量积分法判断结果，每张切片随机选取10个高倍镜视野（倍），计数个胆囊癌细胞及正常胆囊细胞并统计分数。阳性细胞数记分：5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，75%为4分；染色强度记分：淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。以阳性细胞数和染色强度乘积作为最终判断结果：1分为高表达，≤1为低表达。免疫组化染色结果根据盲法进行，由本院两位病理医师同时判定，如结果不一致，则由第三位病理医师复阅判定。

1.2.4qPCR检测NOX1mRNA的表达水平：用Trizol法提取胆囊癌及正常胆囊组织中总RNA，在紫外分光光度计上对RNA纯度及浓度进行定量，A/A=1.8～2.2，浓度大于ng/μL。用TaKaRa公司反转录试剂盒（PrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser）逆转录1μg总RNA，去除基因组DNA反应条件为42℃2min，4℃骤冷；反转录反应条件为37℃15min，85℃5s。NOX1及内参基因（GAPDH）引物均跨内含子，在Primer3软件上设计，由上海杰李生物公司合成，引物序列如下：NOX1-FP：5-TGAGATGTGGGATGATCGTGAC-3；NOX1-RP：5-ATCACAACCTTCTGCTGGGAG-3；GAPDHFP：5-TCTCCTGCGACTTCAACA-3；RP：5-TGGTCCAGGGTTTCTTACT-3。反应条件为：预变性95℃30s；95℃变性5s，60℃退火延伸30s，共进行40个循环；采用2-ΔΔCT值对组件NOX1mRNA的相对表达量进行比较[15]。

1.2.5生存期随访：对胆囊癌患者的生存状况进行定期电话随访，术后总生存期计算为从胆囊癌患者术后到死亡日期，或随访终止日期（年10月31日）。

1.3

统计学分析

胆囊癌组根据NOX1表达量进一步划分为高表达组和低表达组。组间率的比较用卡方检验，组间均值的比较用t检验。Kaplan-Meier法描绘组间生存曲线，Log-Rank法检验组间生存率差异。胆囊癌患者术后总生存期的独立危险因素分析采用多因素的COX回归分析。以P0.05为差异有统计学意义，所有数据均用SPSS17.0统计学软件进行处理。

2结果

2.1

正常胆囊组织与胆囊癌组织NOX1mRNA和蛋白表达情况

qPCR对组织中NOX1mRNA水平进行检测后发现，胆囊癌组织NOX1mRNA相对水平（2.72±1.45）显著高于正常胆囊组织（1.00±0.70）（P0.）（见图1A）。免疫组化对组织中NOX1蛋白表达水平进行检测后发现，胆囊癌组织中NOX1蛋白高表达率为52.3%，也显著高于正常胆囊组织（27.8%）（P=0.）（见图1B）。

2.2

NOX1表达水平与胆囊癌患者临床病理特征的相关性分析

本研究组86例胆囊癌标本中，NOX1高表达样本为45例，高表达率为52.3%。胆囊癌NOX1表达水平与吸烟史、胆囊结石病史、血清CA19-9水平、淋巴结转移、肿瘤分级及TNM分期相关（均P0.05），但与性别、年龄、肿瘤大小、Ki-67阳性率及p53阳性例数无关（均P0.05）（见表1）。

2.3

胆囊癌患者生存曲线及预后的COX回归分析

本研究组86例胆囊癌患者中位生存期为7.1个月，1年生存率为30.7%。NOX1高表达组胆囊癌患者中位生存期为4.8个月，1年生存率为14.3%，NOX1低表达组胆囊癌患者中位生存期为12.2个月，1年生存率为45.5%，Log-Rank检验表明组间差异具有统计学意义（P0.）（见图2）。通过Log-Rank检验，我们发现淋巴结及远处转移、TNM分期、手术方式及NOX1表达水平与胆囊癌患者术后总生存期相关。进一步用Cox回归分析这四个因子，它们都是胆囊癌患者预后的独立相关因素（均P0.05）。

3讨论

胆囊癌早期缺乏特异性临床症状，缺少有效的血清生物学标记和可靠的影像学诊断方法，严重影响了胆囊癌患者的治疗及预后。因此，寻找胆囊癌有效的分子生物学标志，有效预判胆囊癌的恶性程度、进展情况及预后是当前研究的热点。

氧化应激在肿瘤的发生发展过程中发挥了十分重要的作用，不仅可以通过可以异常氧化蛋白质，使得其生物活性丧失，还可以损伤DNA双联链，引入碱基突变及DNA双链畸变，从而促进原癌基因激活及抑癌基因失活，导致正常细胞恶变[16]。同时，氧化应激反应还可以刺激肿瘤细胞增殖相关基因突变等，这些均有助于加速肿瘤细胞变异，增强肿瘤细胞的恶性程度。NOX1是诱导氧化应激反应的关键酶，通过升高细胞内ROS水平，广泛参与肿瘤细胞增殖、迁移、凋亡和细胞外基质重构等病理生理过程。Montalvo-Javé等[17]研究表明，NOX1可以诱导胃癌细胞内氧化应激的产生，进而提高细胞周期蛋白D1水平，促进胃癌细胞的增殖。而抗氧化剂鞣花酸可以通过降低NOX1表达水平，抑制前列腺癌细胞的增殖和克隆形成[18]。此外，NOX1还可以通过激活AMPK信号通路，上调基质金属蛋白酶MMP7的表达量，促进结肠癌的转移侵袭[19]。本研究表明，NOX1在胆囊癌组织中表达水平较正常胆囊组织显著升高，且胆囊癌组织NOX1表达阳性的患者淋巴结及远处转移率明显高于NOX1阴性表达者。此外，统计结果还显示，TNM分期越晚的胆囊癌患者，其NOX1表达的阳性率越高。这些证据提示，NOX1表达水平与胆囊癌发生、转移及浸润的过程密切相关。

近来多项研究表明，肿瘤组织NOX1表达水平可以作为一个分子标志物，对患者的评估和预判，可以提前指导肿瘤的临床治疗[20]。本研究也发现NOX1高表达的胆囊癌患者中位生存期及1年总生存率显著性低于NOX1低表达的胆囊癌患者，且NOX1表达水平是影响胆囊癌患者预后的独立危险因素，提示NOX1高表达介导的促肿瘤作用，在降低胆囊癌患者的生存状况中发挥重要作用。NOX1作为肿瘤氧化应激的关键因子，通过细胞内一系列的信号转导通路，诱导肿瘤细胞的恶性转化，在胆囊癌中也可能是通过上述分子机制，提高胆囊癌细胞的恶性程度，降低患者的生存期限。

综上所述，本研究发现胆囊癌细胞中NOX1高表达，并与肿瘤的转移情况、分化程度、TNM分期及临床生存期相关，通过检测胆囊癌细胞中NOX1的表达水平，可以更好地预测疾病的进展程度，并可以作为指导临床治疗和预测临床生存期的重要参考指标。而NOX1是通过何种分子生物学机制促进胆囊上皮细胞的恶性转化将是下一步研究的重点。

引证本文：

施永恒,陈晓宇,刘强,等.NADPH氧化酶1在胆囊癌组织中的表达及临床意义[J].肝胆胰外科杂志,,30(4):-.

《肝胆胰外科杂志》

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