治疗耐药性甲状腺未分化癌的新靶点LncR

原文标题：LncRNANEAT1enhancestheresistanceofanaplasticthyroidcarcinomacellstocisplatinbyspongingmiR-9-5pandregulatingSPAG9expression.DOI:10./ijo..甲状腺癌是一种常见的内分泌恶性肿瘤，近年来发病率持续上升。根据组织学特征，甲状腺癌分为来源与甲状腺滤泡上皮细胞的甲状腺乳头状癌（papillarythyroidcarcinoma,PTC）、甲状腺滤泡状癌（follicularthyroidcarcinoma,FTC）和甲状腺未分化癌（anaplasticthyroidcancer,ATC），以及来源于滤泡旁C细胞的甲状腺髓样癌（medullarythyroidcancer,MTC）。其中，ATC发生率虽然较低，约占甲状腺癌的1%-2%，但是恶性程度高。ATC对传统癌症治疗方法，例如顺铂（cisplatin,DDP）的耐受性导致其预后不良。这里向大家介绍一篇发表在Internationaljournalofoncology上的文章，其研究结果表明，NEAT1在ATC细胞耐受顺铂（cisplatin,DDP）过程中起重要作用，这可能与NEAT1调控肿瘤细胞的miR-9-5p-SPAG9通路相关。长链非编码RNA（longnon?codingRNA,lncRNA）核富集转录本（nuclearparaspeckleassemblytranscript1,NEAT1）位于人11号染色体上的多发性内分泌瘤病（multipleendocrineneoplasia,MEN）I型的转录位点转录而来，其转录产物定位在亚核体（paraspeckles）上。NEAT1与亚核体中多种蛋白结合，共同参与了亚核体的形成和形态维持，从而参与基因表达的调控。已有研究表明，NEAT1是一种原癌基因，与多种癌症的发生发展有关，而且与癌症药物抗性有关。

作者首先利用RT-qPCR分析了NEAT1在ATC组织及其邻近正常甲状腺组织中的表达情况。结果显示，ATC组织中NEAT1的表达明显上调（Figure1A）。检测NEAT1在ATC细胞系（SW和C）和人正常甲状腺细胞系（Nthyori31）中的表达情况，发现与正常甲状腺细胞相比，ATC细胞系NEAT1的表达水平显著升高（Figure1B）。下一步，作者将NEAT1的表达量变化于临床数据进行相关性分析，如Table1所示，NEAT1的表达与TNM期以及淋巴结转移存在显著相关性。

Figure1NEAT1在ATC组织和细胞系中表达量上调

Table1NEAT1与ATC临床数据的相关性分析

接下来，作者对NEAT1在ATC耐DDP中的作用展开研究。利用siRNA干扰ATC细胞系（SW和C）中NEAT1的表达，随后用DDP处理ATC细胞。Figure2A结果表明，与对照组相比，si-NEAT1干扰效率为57%（SW）和62%（C）。沉默NEAT1使ATC细胞的增殖能力和侵袭能力显著下降，同时促进了细胞的凋亡（Figure2BC;FigureS1）。利用Westernblotting检测发现，NEAT1沉默抑制了Bcl-2的表达，促进了细胞凋亡相关蛋白Bax和C-caspase3的表达（Figure2DE）。NEAT1沉默还能上调自噬体膜蛋白LC3-II/I的表达并抑制受体p62的表达（Figure2FG），表明NEAT1促进了ATC的自噬。

Figure2沉默NEAT1对ATC肿瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响

FigureS1沉默NEAT1对ATC细胞的侵袭能力的影响

与单独沉默NEAT1的细胞和单独使用DDP处理的细胞相比，沉默NEAT1的同时进行DDP处理会更明显地抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、促进细胞自噬的程度（Figure2B-G）。综上所述，沉默NEAT1能提高ATC细胞对DDP的敏感性。

接下来，作者进一步探究NEAT1影响ATC细胞对DDP敏感性的分子机理（Figure3）。通过StarBasev.2.0软件预测发现，NEAT1可能与miR-9-5p结合。利用双荧光素酶报告系统、RIP和RNApull-down分析两者的结合情况，结果表明，NEAT1能够靶向结合miR-9-5p，并抑制ATC细胞中miR-9-5p的表达。

Figure3NEAT1特异结合miR-9-5p并抑制其表达

下一步，作者探究了miR-9-5p对ATC细胞耐DDP的影响。RT-qPCR检测结果表明miR-9-5p在ATC组织和细胞中的表达水平显著下调（Figure4AB）。随后构建miR-9-5p模拟物研究miR-9-5p在ATC细胞的功能，模拟物转染ATC细胞后miR-9-5p的表达水平显著上升（Figure4C）。转染miR-9-5p模拟物能抑制ATC细胞增殖、促进细胞凋亡以及细胞自噬（Figure4D-G）；在miR-9-5p过表达并且用DDP处理ATC细胞时，这种作用更明显（Figure4D-G）。以上结果表明，细胞内的miR-9-5p能提高ATC细胞对DDP的敏感性。

Figure4细胞中过表达miR-9-5p能提高ATC细胞对DDP的敏感性

既然miR-9-5p的过表达与NEAT1的低表达都能增强ATC细胞对DDP的敏感性，那么NEAT1是否通过miR-9-5p实现对ATC细胞耐药性的调控呢？作者同时抑制ATC细胞中NEAT1和miR-9-5p的表达，再用DDP处理。结果表明，共转染anti-miR-9-5p来抑制miR-9-5p的表达，能够拮抗沉默NEAT1导致的ATC细胞对DDP的敏感性增强，而且NEAT1的沉默对ATC细胞的增殖、凋亡和自噬的影响也显著降低（Figure5）。结果表明，NEAT1通过调控miR-9-5p实现对ATC细胞耐药性的调控。

Figure5NEAT1通过调控miR-9-5p实现对ATC细胞耐药性的调控

接下来，作者利用TargetScan软件预测miR-9-5p的靶基因，找到可能与miR-9-5p结合的靶基因SPAG9，这是一种原癌基因。通过一系列实验证明，miR-9-5p直接靶向结合SPAG9，并调控SPAG9在ATC细胞中的表达（Figure6）。

Figure6miR-9-5p直接靶向结合SPAG9

进一步的功能研究发现，SPAG9的过表达能挽回沉默NEAT1对ATC细胞增殖、凋亡和自噬的调控作用（Figure7）。以上结果表明，NEAT1通过miR-9-5p-SPAG9调控网络，实现对ATC细胞耐DDP的调控。

Figure7SPAG9的过表达能挽回沉默NEAT1对ATC细胞增殖、凋亡和自噬的调控作用

为了验证NEAT1在体内模型中调控ATC的DDP耐受性的作用，作者进行了动物模型体内实验。将ATC细胞（SW和C）注射到小鼠体内，构建荷瘤小鼠模型。利用慢病毒干扰荷瘤小鼠体内NEAT1的表达或者用DDP处理，均导致异源肿瘤的体积减小和重量减少，而且干扰NEAT1表达的同时用DDP处理对肿瘤生长的抑制作用更强（Figure8AB）。慢病毒干扰NEAT1表达导致异源肿瘤中NEAT1和SPAG9的表达均下调，而miR-9-5p的表达上调。Westernblotting检测发现，慢病毒干扰NEAT1表达使异源肿瘤中p62表达下调而LC3-II/I表达上调（Figure8C-F）。

Figure8NEAT1在体内模型中调控ATC的DDP耐受性的作用

综上所述，通过沉默NEAT1可以调控miR-9-5P/SPAG9通路，这可能有助于减轻甲状腺未分化癌对DDP的耐药性。作者循序渐进，证明NEAT1在甲状腺未分化癌中的重要作用，为靶向NEAT1来治疗甲状腺未分化癌提供理论基础。

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文章

蔡清韵

编辑

陈慧玲

　　　　　　　　　　　　　　　　

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